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周斌（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心）一个人的血缘关系会对他的一生产生深刻的影响。那么，身体里的30万亿个细胞所构成的微观社会里，由细胞分裂所构成的谱系关系，又对每个细胞产生了怎样的影响？回答这个问题需要可以给细胞打上各不相同的谱系标记，然后在需要的时刻读取细胞谱系信息，同时也获得其它的状态信息，包括基因表达和表观修饰。年10月17日，医院的李莉博士，FernandoCamargo教授和西湖大学的王寿文研究员在Cell杂志发表题为Amousemodelwithhighclonalbarcodediversityforjointlineage,transcriptomic,andepigenomicprofilinginsinglecells的研究论文，开发了新一代谱系追踪小鼠DARLIN，以及多组学谱系追踪技术Camellia-seq。这项技术为系统理解细胞的分化、发育、迁移、稳态等一系列重要问题提供了全新的手段。技术的突破此前也曾有过类似的谱系追踪小鼠，比如CARLIN。CARLIN通过Cas9在基因组上的特定位点进行编辑，导致随机突变。这些突变发生在无关紧要的区域，并不会影响细胞的行为,却可以记录细胞的谱系。然而CARLIN仅能产生44,种不同的标记。这是因为Cas9导致的突变多半是大片段的删除，限制了突变的多样性。图1.DARLIN的小鼠特点与基因构造。为了解决突变多样性低的问题，该研究在CARLIN小鼠里引入了Cas9-TdT融合蛋白，并将原来的一个突变位点扩展到三个相互独立的突变位点(CA,TA,RAtargets)，并将其命名为DARLIN！TdT是一种广谱的DNA聚合酶，可以在Cas9导致DNA双链断裂后有效插入更多的碱基，从而增加突变的多样性。结果显示，DARLIN可以实现超过了的突变组合，远远超过了一只成年小鼠的细胞数(~)。DARLIN小鼠的另一个亮点是既能高效地给细胞打上谱系标记，也能很好地检测出细胞的谱系。而这正是此前的谱系追踪小鼠的短板。70%的DARLIN细胞都可以检测到被编辑过的谱系标记，而这一比例在CARLIN中只有10%。图2.Camellia-seq建库方法。单单记录谱系是不够的，还需要有强大的手段可以读取包括谱系在内的细胞的全部信息。他们开发的Camellia-seq，可以在单细胞层面同时测量细胞的转录组，DNA甲基化，染色质可及性，以及细胞谱系。此前的测序技术只能获得单个细胞的谱系和转录组，或谱系和表观组，但不能兼而有之。因此，仅从概念层面，Camellia-seq就已经是一大进步了。谱系能告诉我们什么？该研究从三个独特的问题入手——细胞命运选择、细胞迁移、以及细胞记忆——展示了DARLIN小鼠与Camellia-seq的广阔应用前景。图3.DARLIN小鼠与Camellia-seq的运用场景举例。研究细胞命运选择是谱系追踪技术的一个经典应用。胚胎期的造血干细胞（HSC）群体里是否存在具有不同命运偏好的亚群呢？该研究发现存在一群HSC只有巨噬细胞这一种命运选择，且他们的基因表达特征表明他们更接近长期造血干细胞。通过对数据进行局部采样以模拟CARLIN小鼠可能产生的结果，该研究表明CARLIN小鼠由于谱系追踪效率过低，无法鉴别出HSC亚群存在的命运偏好。这进一步显示了DARLIN小鼠的优越性。成体小鼠的HSC在不同骨髓之间是否会迁移呢？此时血细胞数目极多，即使只考虑分化早期的前体血细胞，也有几万到几十万，这就要求工具鼠具有比这高得多的谱系标记多样性。该研究先诱导谱系标记，几个月后再对小鼠进行谱系分析。研究发现，每一块骨髓的HSC主要负责“本地”的造血任务（本地的血细胞共享相同的谱系标记），但HSC在不同骨髓之间也会有少量的迁移（来自不同骨髓的HSC都有相同的谱系标记）。作为反面对照，他们对成体小鼠进行谱系标记后立刻进行谱系分析（因此细胞没有时间进行迁移），结果显示不同骨髓之间的血细胞确实没有相同的谱系标记，从而证实了DARLIN小鼠对大型复杂生物系统进行谱系追踪的准确性。细胞记忆是这项研究中最为有趣的一个发现。小小的细胞也会有记忆吗？是的，这是一种分子印记，使得来自相同谱系的细胞具有更相似的分子特征。就拿基因表达来说，虽然都是HSC，因此具有大致相同的基因表达，但是由于噪声等原因，不同的细胞还是具有略微不同的基因表达，这些分子印记在一定程度上是可以遗传的。结合Camellia-seq和DARLIN小鼠，他们测量了来自相同谱系多个造血干细胞的转录组、DNA甲基化和染色质可及性，结果发现“血缘关系”更近的造血干细胞具有更相似的DNA甲基化特征（而不是相似的转录组和染色质可及性），即使这些细胞的共同祖先来自两个月以前，期间经历了很多代的细胞分裂和迁移。这是首次用单细胞谱系追踪的方法，直接证实了来自DNA甲基化的分子印记可以在正常体细胞中稳定遗传好几个月。计算的挑战“在数据分析中，我碰到的第一个挑战是如何处理大量的数据，并保证结果的可重复性；第二个就是如何准确地找到那些真正来自同一谱系的细胞群体。”王寿文说，“最大的挑战是分析Camellia-seq的数据，因为这种多组学数据非常稀疏，且具有某种系统性的偏差。为了解决这些问题，我开发了一套完整的数学模型和分析方法，并制作成了相应的软件。”“研究的一大乐趣，就是它给你带来的惊喜。数据在那边，你要认真听它说话，而不是把你的想法强加给它。好的数据会讲一个更加生动、让你意想不到的故事，并为你指引新的研究方向！”王寿文说，“细胞记忆就是这样一个故事！”李莉博士是本文第一作者，王寿文研究员和FernandoCamargo教授为共同通讯作者。专家点评周斌（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心研究员，新基石研究员）近年来，DNA条形码技术在谱系示踪领域取得了迅猛的发展。目前，这一技术已经分化出多种不同的方法和技术。最早的尝试由Camargo实验室进行，他们采用了睡美人转座子系统来研究小鼠造血系统的动态克隆变化，从中揭示出粒细胞的来源并证明了稳态下的长时程造血干细胞的谱系受到了极大的限制(Sunetal.,)。随后，他们结合了单细胞测序技术，用该系统揭示了长时程造血干细胞和多能祖细胞分别为两个独立的巨核细胞来源，并且多能祖细胞表现出显著的异质性(Rodriguez-Fraticellietal.,)。另一种条形码技术是Polylox系统，年裴唯珂等在DNA链上排列了10个互补的loxP序列，通过可诱导的Cre酶介导的同源重组，创造了种不同的序列。这一系统被用于E9.5小鼠的研究，揭示了红细胞祖细胞和粒细胞不是来自骨髓祖细胞，同时也证实了髓系细胞和淋巴系细胞的谱系分离。目前，最广泛使用的DNA条形码技术是CRISPR/Cas9系统，通过造成DNA双链断裂，将插入或删除的碱基用作遗传标记。(sc)GSETALT、LINNAEUS、scScarTrace等方法已经在斑马鱼早期发育研究中得到了应用，并根据遗传标记构建了细胞谱系树(Alemanyetal.,;McKennaetal.,;Rajetal.,;Spanjaardetal.,)。此外，有两项研究使用CRISPR/Cas9相关的遗传标记技术，研究了小鼠胚胎的早期发育过程(Chanetal.,;Kalhoretal.,)。年，Camargo实验室首次报道了基于CRISPR/Cas9系统的CARLIN小鼠条形码工具，不过由于其条形码多样性较低（44种）且会标记所有细胞，因此应用受到一定的限制。今年，陈跃军实验室在报道了Cre诱导的小鼠条形码CREST系统(Xieetal.,)，使用类似的策略在小鼠胚胎的中脑腹侧vMB揭示了多巴胺能神经元的多个起源以及这些祖细胞之间的异质性。本研究在Camargo实验室之前发表的CARLIN技术基础上，开发了DARLIN技术，相比CARLIN，DARLIN的改进包括：（1）将Cas9替换为Cas9-TdT，terminaldeoxynucleotidyltransferase(TdT,末端脱氧核苷酸转移酶)的存在让DNA双链切割位点引入更多碱基插入，极大增加了可能的条形码多样性，同时提高了可使用的稀有等位基因的数量；（2）使用三个独立的目标数组，分别在3个不同基因座位上：Rosa26,Col1a1,TIGRE，采用正交策略进一步显著增加了条形码多样性；（3）引入了Camellia-seq的多组学测序技术，从多个维度描述了细胞谱系变化过程中的变化。与以往技术相比，DARLIN技术克服了许多限制，如可能形成的条形码数量有限、在起始标记阶段不同细胞可能形成相同条形码的问题等。它显著增加了可使用的稀有等位基因的比例，降低了相同细胞产生相同条形码的概率，从而使更多细胞能够用于科学问题的研究，提供了更全面和完整的细胞谱系关系。这一改进将极大扩大该技术在成体干细胞、组织修复和肿瘤等科学问题中的应用范围，为多个领域提供了新的研究策略和工具。这项技术的改进不仅为我们提供了更强大的工具来探究细胞谱系和细胞命运规律，而且有望在多个领域产生深远的影响。未来，基于DARLIN技术不断的发展和应用将有助于我们更好地理解生物体内细胞的多样性和发育过程，为生物医学研究、药物开发和疾病治疗提供更多的可能性。这一创新将继续推动科学的前沿，为我们解开生命的谜团提供更多的见解。课题组招聘王寿文是西湖大学生命科学学院研究员、博士生导师，同时任西湖大学理学院物理系兼聘教授。近几年来，以第一或共同通讯作者身份在Cell、NatureBiotechonology、NatureCommunication等杂志发表5篇SCI论文。王寿文课题组致力于结合谱系追踪与单细胞多组学技术，开发前沿的算法，深入理解细胞的命运选择，以及组织的发生、稳态、病变等基本生物学问题。课题组在实验和计算方向上都已初具规模，形成了多学科交叉的良好氛围。目前仍有多个博后、博士生、和科研助理岗位，欢迎拥有实验或计算背景的青年才俊加盟。详情请看
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